二、 RSV基因组结构和功能

RSV是一段有包膜、非节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科肺病毒属，包括A、B两种亚型，RSV基因组长15.2kb，包含10个开放阅读框（ORF），能够编码11种蛋白质，包括9个结构蛋白和2个非结构蛋白，其各个蛋白质的功能如下：

2.1   NS1和NS2（非结构蛋白）：参与病毒复制和感染，抑制宿主凋亡。

2.2   N（核蛋白）：与病毒RNA形成核糖核蛋白复合体的核衣壳，病毒复制和转录的核心。

2.3   P（磷蛋白）：与N蛋白一起成成核糖核蛋白，参与病毒RNA合成和加工。

2.4   M（基质蛋白）：参与病毒粒子的形成和出芽，影响宿主细胞的基因表达。

2.5   SH（小疏水蛋白）：跨膜蛋白，可能与病毒逃逸有关。

2.6   G（粘附蛋白）：G蛋白负责将病毒吸附到宿主细胞表面，启动感染过程。G蛋白高度变异，与抗原表位决定簇和病毒基因多样性的关系密切，在区分RSV A、B亚型方面起重要作用。

2.7   F（蛋白）：F蛋白介导病毒与宿主细胞膜的融合，使病毒进入细胞内。因具有较高的免疫原性，成为药物和疫苗研究的主要靶点。

2.8   M2（基质蛋白）：M2-1和M2-2；M2-1对病毒转录重要，M2-2控制从转录到基因组复制的转变。

2.9   L（RNA聚合酶蛋白）：具有RNA聚合酶活性，负责病毒RNA的复制和转录。

在RSV的感染过程中，融合蛋白F和粘附蛋白G发挥关键作用。G蛋白作为一种II型跨膜蛋白，主要起附着作用，能够促进病毒和宿主细胞的黏附。另外，G蛋白高度变异，与抗原表位决定簇和病毒基因多样性密切相关，在RSV的A和B两种亚型中起重要作用。

F蛋白是一种I型三聚体融合蛋白，能够介导病毒膜和宿主细胞膜融合，发挥主要作用。在感染细胞之前，F蛋白呈现一种形状（Pre-F），在感染过程中，F蛋白会转变成第二种不可逆形状(Post-F)。Pre⁃F蛋白具备6 种抗原表位，即SiteⅠ、II、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ø，而Post⁃F仅包含Pre⁃F的前4种表位。当免疫系统遇到带有Pre⁃F蛋白的RSV病毒，它就会产生强有力的抗体，但是如果遇到带有Post⁃F蛋白质的病毒，就会产生更少的抗体。

三、RSV单克隆抗体药物研发进展

目前，已经有10款抗RSV单抗处于临床试验阶段，其中有5款处于III期临床（3款已经终止），1款处于II期，4个处于临床I期（其中已经终止1款）。

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帕利珠单抗（Palizumab）和尼塞韦单抗（nirsevimab）已被批准用于预防婴儿RSV感染。

第一代RSV单克隆抗体：帕利珠单抗（Palizumab）

1998年，人源化单克隆抗体帕利珠单抗（Palizumab）被批准用于预防RSV感染，适用于妊娠29周之前出生且RSV季节开始时年龄小于12个月的婴儿。帕利珠单抗是一种IgG1类型的单克隆抗体（mAb），通过与RSV的F蛋白进行特异性结合，阻止病毒与宿主细胞膜的融合，从而达到抑制病毒感染的效果。

新一代单克隆抗体：尼瑞单抗（Nirsevimab）

随着单克隆抗体筛选技术的进步，更多具有高效靶向RSV F蛋白的新型抗体被发现，其中包括尼瑞单抗（Nirsevimab）。Nirsevimab保留了D25mAb对抗Pre-F构象的独特表位识别能力，同时引入YTE突变延长了体内半衰期至85至117天，表现出了良好的安全性。

四、RSV疫苗的研发进程

4.1   RSV post-F蛋白疫苗的历史问题

关键抗原的选择对于开发高效的RSV疫苗极其重要，作为RSV感染过程中粘附和入侵的F蛋白和G蛋白成为了理想靶点。自1957年发现RSV后，科研工作者便针RSV开展了各种研究。1960年，辉瑞首先开发了针对Post-F的蛋白FI-RSV疫苗并开展了婴儿临床试验。然而，试验结果显示，该疫苗不仅没有保护血清阴性儿童免收RSV的侵害，反而诱发了增强型呼吸道疾病ERD，导致了80%儿童的住院以及2人的死亡。而造成这一结果的原因是福尔马林导致疫苗制剂中和表位破坏，进行FI-RSV注射后，导致了机体的免疫紊乱，主要表现为CD4+T细胞数量和Th2细胞因子水平增加。同时，CD8+T细胞数量和Th1细胞因子水平降低可能也有助于ERD，这让大家意识到了RSV疫苗的研发必须要考虑ERD的风险，至此，RSV一直没有新的研究进展。

4.2   RSV疫苗研发新进展

直到2013年，随着结构蛋白学的快速发展，pre-F蛋白的构想被破译，才开始了F蛋白的研发，RSV疫苗研究才有了新的进展。目前，已有2款RSV疫苗被FDA获批上市，分别是葛兰素史克（GSK）的Arexvy、辉瑞（Pfizer）的Abrysvo。此外，还有1款RSV疫苗处于NDA阶段，30款RSV疫苗临床试验阶段。

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五、RSV机制研究的主要内容

5.1   病毒复制和感染动态的实时观察

RSV-GFP病毒可以在感染的宿主细胞中表达绿色荧光蛋白（GFP），通过荧光显微镜可以实时观察病毒感染和复制的动态过程。这种方法可以用来研究病毒在宿主细胞内的复制周期、病毒粒子的组装和释放等。

5.2   病毒与宿主细胞相互作用的研究

利用RSV-GFP病毒可以研究病毒蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用。例如，通过共免疫沉淀（co-IP）技术结合质谱分析（LC-MS/MS）来鉴定与RSV M2-1蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，从而揭示病毒如何在宿主细胞内进行复制和传播。

5.3   病毒药物筛选和评估

RSV-GFP病毒可以用于抗病毒药物的筛选和评估。通过观察GFP的表达水平变化，可以评估药物对病毒复制的抑制效果，从而筛选出有效的抗病毒药物。

5.4   病毒免疫逃逸机制的研究

利用RSV-GFP病毒可以研究病毒如何逃避宿主的免疫反应。通过观察病毒感染后宿主细胞的免疫应答，可以了解病毒的免疫逃逸机制

5.5   疫苗开发与评估

RSV-GFP病毒可以作为疫苗开发的研究平台，通过表达特定的病毒抗原，研究宿主对这些抗原的免疫应答，进而开发出有效的疫苗

5.6   病毒结构和功能的研究

利用RSV-GFP病毒可以研究病毒结构蛋白的功能，例如通过观察GFP融合蛋白的定位和动态变化，了解病毒结构蛋白在病毒感染过程中的作用

六、RSV的疫苗研发

RSV 候选疫苗可分为减毒活疫苗 （LAV） 或嵌合疫苗，以及基于蛋白质、基于重组载体和基于核酸的疫苗。

6.1   减毒活疫苗（Live Attenuated Vaccine, LAV）

减毒活疫苗是通过培养传代或者基因编辑等手段减弱病原体的致病性，使RSV病毒失去或大大降低引发感染的能力，但仍然保留能够RSV病毒刺激免疫系统产生保护性免疫反应的特性。当机体接种RSV减活疫苗后，这些弱化的RSV病毒可以在体内进行复制，从而模拟自然感染的过程并激发强烈的免疫应答。

特点：

·   优点： 能够诱导机体的细胞免疫和体液免疫；并且只需要一次接种即可获得长期保护。

·   缺点： 由于RSV病毒仍然存在较低的活性，因此对于免疫功能低下的个体存在安全风险，研发过程中需要确保病毒不会恢复毒性；生产难度较大，成本较高。

6.2   嵌合疫苗

嵌合疫苗是指使用腺病毒或其他非致病性病毒作为载体，将RSV的F或者G蛋白序列等插入载体病毒基因组中，构建出新的重组病毒。利用宿主对载体病毒的已有免疫力以及引入目标病原体的关键抗原成分，从而诱导针对RSV病毒的特异性免疫反应。

特点：

·   优点： 可以结合两种病毒的优势，增强免疫原性和安全性；适用于多种病原体的联合疫苗开发。

·   缺点： 设计复杂，需要考虑载体病毒的选择及其潜在的安全性问题；可能受到预先存在的抗载体免疫的影响。

6.3   基于蛋白质的疫苗

基于蛋白质的疫苗直接使用病原体表面的特定蛋白质（如F蛋白或Pre-F蛋白）作为免疫原，通过化学合成或生物技术手段大量生产，并将其配制成适合注射的形式，这类疫苗通常不含活病毒，因此非常安全。比如目前已上市的RSV疫苗如GSK的Arexvy和辉瑞的Abrysvo都属于基于蛋白质的疫苗，它们利用CHO细胞表达并纯化稳定的Pre-F蛋白，经过严格的质量控制后制成成品。

在今年4月份，国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）也正式受理了采用CHO细胞开展的重组蛋白技术路线的国产RSV疫苗（受理号：CXSL2400228）。

特点：

·   优点： 基于蛋白质生产的疫苗生产工艺成熟，易于大规模生产和质量控制；同时，安全性较高。

·   缺点： 免疫效果相对较弱，需要添加佐剂来增强免疫反应。

6.4   基于重组载体的疫苗

基于重组载体的疫苗利用病毒或细菌作为“运输工具”，携带RSV的关键抗原基因进入宿主体内。这些载体可以在宿主细胞内表达目标抗原，进而激活免疫系统产生特异性免疫反应。

特点：

·   优点： 可以实现高效的抗原递送，诱导强效且持久的免疫反应；适用范围广，可用于多种病原体的疫苗开发。

·   缺点： 需要考虑载体本身的安全性及预存免疫的问题；研发周期较长，技术要求较高。

6.5   基于核酸的疫苗

基于核酸的疫苗主要包括DNA疫苗和mRNA疫苗。它们的工作机制是将编码目标抗原的遗传物质（DNA或mRNA）直接注入人体，使宿主细胞自身成为“微型工厂”，合成并表达相应的抗原蛋白，从而激活免疫系统产生免疫反应。据国家药监局官网中心显示，冻干mRNA呼吸道合胞病毒疫苗NR2222临床试验申请（IND）获批，这是国内首个冻干剂型mRNA疫苗获批临床，标志折mRNA疫苗领域的重要突破。

特点：

·   优点： 开发速度快，适应性强，可以根据新出现的变种迅速调整；生产成本相对较低，易于规模化生产。

·   缺点： 技术较新，目前公众的接受度有待进一步提高；同时核酸递送效率和稳定性有待进一步提升。

七、RSV的中和抗体检测

呼吸道合胞病毒 （RSV） 特异性中和抗体是RSV 感染的主要保护机制。目前，RSV 中和测定已成为临床前动物模型、流行病学研究和临床试验中评估血清抗体中和活性的关键功能方法。

7.1   斑减少中和试验（PRNT）

斑减少中和试验是中和检测抗体的金标准。稀释后的血清与RSV病毒进行混合，RSV感染扩散杀死周围细胞进而形成空斑。当被感染细胞能够产生中和抗体时，抗体与RSV结合，阻止RSV感染细胞，那么空斑的数量就会减少。因此通过定量测量感染细胞形成的空斑，可以获得中和抗体对RSV感染宿主细胞的病理影响。

·   优点：高特异性，能够模拟RSV病毒感染的过程，具有较高的特异性和准确性。

·   缺点：周期长，操作条件要求高、成像高、通量低等

7.2   微量细胞中和试验（MNT）

该方法类似于PRNT，基于RSV病毒感染细胞后引起的细胞病变效应（CPE）衡量中和抗体的活性。当RSV病毒感染宿主细胞时，会在易感细胞层上引起细胞的形态学变化，如细胞圆化、脱落、死亡等。如果存在中和抗体，则抗体与RSV病毒结合，阻止RSV进入易感细胞，从而你减少或者抑制CPE的发生。

·   缺点：周期长，灵敏性低于PRNT

·   优点：高通量筛选，可用于大规模筛查，操作简单。

7.3   微量病毒中和试验&蛋白检测（ELISA/MSD检测方法）

微量病毒中和试验（Micro Neutralization Assay, MNT）结合ELISA（酶联免疫吸附试验）或MSD（电化学发光法）用于检测RSV蛋白含量。

MNT部分基于病毒感染细胞后引起的细胞病变效应（Cytopathic Effect, CPE）或病毒复制情况来衡量中和抗体的活性。ELISA/MSD通过检测感染后细胞分泌或表达的特定病毒蛋白（如RSV F蛋白或N蛋白），定量分析RSV的蛋白含量，从而间接反映RSV的感染水平。

·   优点：能够同时评估中和抗体的活性和测量病毒感染后细胞分泌或表达的特定病毒蛋白。

RSV微孔病毒中和后检测病毒蛋白含量

7.4   RSV病毒报告基因中和试验

一种评估血清样本中和抗体效价的高效体外实验方法。通过将荧光报告基因（GFP/Luciferase）插入RSV基因组中，使得病毒感染细胞后能够产生荧光信号。如果存在中和抗体，这些抗体会和病毒结合，阻止RSV感染细胞，减少或者抑制报告基因的表达。

7.5   RT-qPCR方法进行RSV病毒载量检测

将RSV病毒的RNA逆转录为cDNA，然后对已知的特定基因片段进行扩增和实时荧光监测，从而实现对病毒载量的精确测定。

7.6   ELISPOT进行RSV抗原多肽特异性T细胞反应检测

ELISPOT是一种灵敏性强的体外免疫学检测方法，主要用于评估抗原刺激下的T细胞反应。当T细胞受RSV多肽刺激后，被激活分泌包括INF-γ，IL2，IL6等细胞因子。ELISPOT利用报备在微孔板上的特异性抗体捕捉这些分泌物，通过酶促反应产生可见斑点，这些斑点代表分泌相应细胞因子的活化T细胞。

八、RSV疫苗与治疗药物开发中的科研工具与试剂

在RSV疫苗和治疗药物的开发过程中，需要使用多种科研工具、试剂和细胞模型。以下是一些常用的工具和推荐的品牌：

1. 人源性细胞系：用于RSV感染研究的人源性细胞系，如A549、HEp-2等，如ATCC，其提供的细胞系经过严格质量控制，具有高稳定性。

2. 动物模型：用于RSV研究的动物模型，如棉鼠（M. musculus）和小鼠模型，Taconic Biosciences公司提供的动物模型在RSV研究中广泛应用。

3. 疫苗开发工具：包括基因工程工具、病毒载体系统和蛋白表达系统。viratree公司提供的带有报告基因的RSV病毒，可以用于RSV中和抗体检测。

4. 抗体试剂：用于检测RSV感染和免疫反应的抗体试剂，如pre-F蛋白、G蛋白、Pre-F蛋白 Elisa检测试剂盒等。

5. RSV检测：用于RSV的AB两种菌株类型的分型检测，如RSV分型检测试剂盒。

Alibiobuy提供RSV完整解决方案，包括从RSV相关动物模型构建到RSV检测，再到各种RSV蛋白抗体Elisa免疫检测等，加速您的药物及疫苗研发进展。